کوتیناز یک آنزیم هیدرولازی است که کوتین را تجزیه می¬کند. کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلی-استری هیدروکسی و اپوکسی اسیدچرب تشکیل شده که عمدتا توسط باندهای استری پیوند یافته¬اند. اسیدهای چرب کوتین معمولا n-c16 و n-c18 هستند و حاوی یک تا سه گروه هیدروکسیل هستند. کوتین نقش کلیدی درحفاظت از گیاهان در برابر عوامل بیماریزا ایفا می کند و تجزیه¬ی آنزیمی آن اولین گام در فرآیند آلودگی بافت گیاهی است. هدف از این پژوهش استخراج کوتین و مقایسه¬ی آنها در میوه¬های مختلف و غربالگری باکتری¬ها و قارچ¬های تولید کننده آنزیم کوتیناز و شناسایی گونه آنها با تعیین توالی ناحیه 16S DNA می¬باشد. با توجه به اهمیت آنزیم کوتیناز به ویژه در صنعت، این مطالعه گامی مهم در شناسایی سویه¬های بومی تولید کننده آنزیم کوتیناز و استفاده از آنها در صنعت به شمار می¬آید. بدین منظور پوست میوه¬های مختلف را جمع¬آوری و در بافر اگزالات جوشانده و بعد از شست¬و¬شو در آون خشک شده و آسیاب گردید. از پودر حاصل به روش کلرفرم متانول کوتین آن جداسازی شد. نتایج نشان می¬داد که درصد کوتین استخراج شده در سیب بیشتر است و احتمالا سیب نسبت به آفات و بیماری¬ها مقاوم¬تر است. در مرحله¬ی بعد جداسازی سویه¬ای تولیدکننده آنزیم از نمونه¬های مختلف انجام شد. نمونه¬ها به داخل پلیت های حاوی محیط کشتی که کوتین تنها منبع کربن است تلقیح داده و سویه¬های غربالگری شده و به کمک سوبسترای اختصاصی پارانیتروفنول بوتیرات فعالیت کوتینازی سنجیده شد. به منظور بررسی تنوع ژنتیکی 6 سویه جداسازی شده با استفاده از نشانگر RAPD مورد مطالعه قرار گرفتند. به این منظورDNA ژنومی از سویه¬های تولیدکننده آنزم کوتیناز به روش جوشاندن، CTAB و کیت استخراج شد و واکنش PCR با استفاده از 9 آغازگر RAPD انجام گردید. برای شناسایی و توالی یابی سویه¬ها با استفاده از rDNA 16S عمل PCR با دو پرایمر 8F و 1541Rانجام شد سپس محصولات PCR برای توالی یابی ارسال شد. این مطالعات نشان می¬دهد که سویه-های جداسازی شده دارای فعالیت کوتینازی مناسبی بوده و میزان بالایی از آنزیم کوتیناز را تولید می¬کنند که قابلیت مصارف تجاری صنعتی دارند. می توانید این تحقیق رشته میکروبیولوژی را به صورت فایل word دانلود نمایید.
مقدمه
استفاده از پلیمرهای گیاهی توسط میکروارگانیسم¬ها مستلزم ترشح آنزیم¬های هیدرولازی است که مهم¬ترین آنها کوتیناز می-باشد. کوتیناز توانایی هیدرولیز انواع استرها و پلی¬استرهای کوچک را داراست. کوتیناز یک آنزیم هیدرولازی است که کوتین را تجزیه می¬کند. کوتین در بیشتر گیاهان وجود دارد و دارای ترکیبات پلی استری هیدروکسی و اپوکسی اسیدچرب است [1]. کوتین یک پلی استر بسیار هیدروفوب غیر محلول در آب و از مشتقات گاما هیدروکسی اسیدچرب می¬باشد که در ساختار کوتیکول گیاهان وجود دارد [2]. اصطلاح کوتین از کوتوس گرفته شده و این اصطلاح در اصل برای توصیف ماده¬ای است که بخشی از اپیدرم برگ را تشکیل داده و در برابر اسیدهای قوی مقاوم است. کوتین در بیشتر گیاهان وجود دارند. مطالعات بر روی کوتین و کوتیکول گیاه از قرن نوزده آغاز شده است. حتی گیاهان عالی که در زیر آب زندگی می¬کنند مانند چمن¬دریا ، زئوسترا¬ مارینا دارای کوتین هستند و مونومرهایی از همان نوع مونومرهایی که در بقیه¬ی گیاهان یافت می¬شود دارند.کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلی¬استری هیدروکسی و اپوکسی¬اسیدچرب تشکیل شده که عمدتا توسط باندهای استری پیوند یافته¬اند[3]. اسیدهای چرب کوتین معمولا n-c16 و n-c18 بوده و دارای یک تا سه گروه هیدروکسیل هستند. کوتین نقشی کلیدی در حفاظت از گیاه در برابر عوامل بیماری¬زا ایفا می¬کند [4] و تجزیه¬ی آنزیمی آن یکی از اولین گام¬ها در فرآیند آلودگی است. در واقع کوتیکول یک لایه¬ی محافظ چربی¬دوست است که برگ¬ها، ساقه¬ها و میوه¬ها را می¬پوشاند. بر روی کوتیکول لایه¬ای از موم پوشیده شده است که علاوه بر اینکه مانع از تبخیر آب گیاه می¬شود در برابر عوامل بیماری¬زا و آفات نیز از گیاه حفاظت می¬کند. استفاده از آنزيم کوتیناز باعث افزايش اثرات دارويي مواد شيميايي كشاورزي شده و همچنين كوتيناز به عنوان يك آنزيم ليپوليتيك در مواد شوينده لباس و ظرف براي چربي زدايي به كار رفته است. تجزيه¬ي پلاستيك¬ها از قبيل پلي¬استرهاي مصنوعي، محصولات محلول در آب با استفاده از كوتيناز بدست آمده است.
ضرورت تحقیق
با توجه به ویژگی ها خاص آنزیم کوتیناز و کاربردهای ان در صنعت و بیوتکنولوژی و نیز چشم انداز روشن در فرایند تجزیه پلاستیک و الاینده های پلی استری موجود در طبیعت، یافتن انزیمی با شرایط مطلوب تر همواره مورد توجه بوده است. آنزیم¬های کوتیناز در باکتری¬ها و قارچ¬ها مطالعه شده¬اند اما آنزیم های کوتیناز گونه های باکتریایی تا کنون به میزان کمتری مورد بررسی قرار گرفته اند.
امروزه یافتن آنزیم¬هایی با خصوصیات جدید و ویژگی¬های مطلوب¬تر که از نظر صنعتی و پزشکی اهمیت دارند یکی از زمینه های مهم پژوهشی در علوم بیوتکنولوژی می باشد. یکی از این آنزیم¬های مهم آنزیم کوتیناز می¬باشد که یک آنزیم هیدرولازی و ترشحی بوده و کوتین را تجزیه می¬کند. انزیم کوتیناز متعلق به خانواده سرین هیدرولازها بوده و به دلیل خواص ساختاری و عملکردی در حذف آلودگی های زیست محیطی اهمیت بسیار زیادی دارد. آنزیم کوتیناز اسیدهای چرب کوتین را با هیدرولیز باندهای استری آزاد می¬کنند. استفاده از پلیمرهای گیاهی توسط میکروارگانیسم ها مستلزم ترشح آنزیم های هیدرولازی است. اگرچه هنوز مشخص نیست که چگونه یک پلیمر می تواند وارد سلول شده و باعث تولید آنزیم های هیدرولازی شود، اما یک احتمال در این زمینه این است که میکروارگانیسم¬ها یک سطح پایه¬ای از چندین آنزیم هیدرولازی ترشح می¬کنند و سپس با عملکرد این آنزیم¬ها بر روی مواد پلیمری، این مواد هیدرولیز شده و محصولات هیدرولیز شده وارد سلول شده و سنتز آنزیم¬ها را القا می کنند .
یکی از مشکلات زیست محیطی در جوامع امروزی تجزیه¬ی زباله¬ها در محیط زیست است. کوتیناز به عنوان یک آنزیم سبز می¬تواند توانایی از بین بردن زباله¬های پلی¬استری را دارا باشد و می¬توان از آن در سنتز پلی¬استرهای قابل تجزیه در طبیعت استفاده کرد.
کوتیناز ها و لیپازها متعلق به گروه استراز ها هستند که قادر به تسریع هیدرولیز باندهای استری هستند. نسبت اجزای سازنده آمینواسیدی کوتیناز باکتریایی به طور کاملا مشخص از کوتیناز قارچی و گیاهی متفاوت است. کوتیناز یک کاتالیست موثر در محیط¬های آبی یا ارگانیک است. این مجموعه ویژگی¬ها باعث شده است که این آنزیم در صنعت و تکنولوژی مورد توجه قرار گیرد. لذا شناسایی سویه¬های مختلف بومی تولید کننده این آنزیم از اهمیت خاصی برخوردار است.
فهرست مطالب
فصل اول معرفی 1
1- 1- مقدمه 2
1- 2- اهمیت و ضرورت تحقیق 2
1- 3- فرضیات واهداف تحقیق 4
فصل دوم مروری بر کلیات و تحقیقات پیشین 6
2- 1- کوتین 7
2- 1- 1- جداسازی کوتین 12
2- 1- 2- دپلیمریزاسیون کوتین 12
2- 1- 3- مونومرهای تشکیل دهنده کوتین 13
2- 3- آنزیم کوتیناز 16
2- 3- 1- کلون و بیان کوتیناز 18
2- 3- 2- ساختار کوتیناز 19
2- 3- 3- عملکرد کوتیناز 26
2- 3- 4- کاربردهای کوتیناز 27
2- 3- 5- استفاده از کوتیناز به عنوان یک بیوکاتالیست در محیطهای غیرمعمول 29
2- 3- 6- عملکرد کوتیناز در واکنشه¬ای هیدرولیزی و سنتزی 33
2- 3- 7- ترانس استریفیکاسیون 35
2- 3- 8- پایداری کوتیناز 36
2- 3- 9- فرایندهای در حال توسعه: بیوراکتور کوتیناز 38
2- 3- 10- مکانیسم عمل کوتیناز 39
2- 3- 11- مقایسه¬ی آنزیم کوتیناز قارچی و باکتریایی 41
2- 4- نشانگرهای ژنتیکی 42
2- 5- نشانگرهای مورفولوژیکی 42
2- 6- نشانگرهای مولکولی 43
2- 7- نشانگرهای پروتئینی یا بیوشیمیایی 44
2- 8- نشانگرهای DNA 45
2- 8- 1- نشانگرهای DNA غیر مبتنی بر PCR 46
2- 8- 2- نشانگرهای مبتنی بر PCR 46
2- 9- نشانگرهای غیر اختصاصی 47
2- 9- 1- RAPD 47
2- 10- نشانگرهای اختصاصی 48
2- 10- 1- AFLP 48
2- 10- 2- SSR 48
2- 10- 3- RFLP-PCR 50
2- 10- 4- RFLP Based PCR با اتصال ناقص 51
فصل سوم مواد، تجهیزات و روش تحقیق 52
3- 1- استخراج کوتین 55
3- 2- نمونه برداری 55
3- 3- غربالگری و جداسازی گونه¬های تولیدکننده آنزیم کوتیناز 55
3- 4- تهیه slant از سویه¬های جدا شده 57
3- 5- نگهداری طولانی مدت سویه¬ها 57
3- 6- تهیه گلیسرول 58
3- 7- تهیه محیط کشتLB 58
3- 8- Assay آنزیمی 58
3- 9- Assay ویژه آنزیمی 60
3- 10- استخراج DNA 60
3- 10- 1- استخراج DNA به روش جوشاندن 60
3- 10- 2- استخراج DNA به رو ش CTAB 61
3- 10- 3- روش استخراج DNA با کیت 64
3- 11- اندازه¬گیری کیفیت و غلظت DNA 65
3- 12- رنگ آميزي با اتيديوم برمايد 69
3- 13- واكنش زنجيره اي پليمراز Polymerase Chain Reaction 70
3- 14- راه اندازی واکنش PCR 74
3- 15- برنامهPCRبرای نشانگرRAPD 76
3- 16- توالی¬یابی سویه¬های تولیدکننده آنزیم کوتیناز با استفاده از 16S rDNA 77
3- 17- الکتروفورز محصولات واکنش PCR 78
فصل چهارم 80
4- 1- بررسی میزان کوتین در میوه¬های مختلف 81
4- 2- جداسازی سویه¬ها 87
4- 3- بررسی فعالیت آنزیم کوتیناز در نمونه¬ها 87
4- 4- نتایج بررسی کیفیت DNA بعد از استخراج 88
4- 5- تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی 6 سویه بر اساس نشانگر مولکولی RAPD 89
4- 6- نتایج حاصل از تجزیه خوشه¬ای بر اساس نشانگر RAPD 89
4- 7- تجزیه به مختصات اصلی 90
4- 8- نتایج تجزیه باندهای حاصل از 8 پرایمر RAPD 92
4- 9- ضریب همبستگی کوفنتیک 93
4- 10- شناسایی و توالی یابی سویه¬ها با استفاده از 16S rDNA 93
فصل پنجم 95
5- 1- استخراج کوتین 96
5- 2- سنجش فعالیت آنزیمی کوتیناز 97
5- 3- استخراج DNA 98
5- 4- تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگر RAPD 98
پیشنهادات 100
6- 1- پیشنهادات 101
فهرست جدول‌ها
جدول 2 1 مطالعه ساختار- عملکرد کوتیناز به کمک تکنی¬کهای مختلف 24
جدول 2 2 فعالیت هیدرولازی کوتیناز نسبت به تنوع گستردهای از سوبستراها 29
جدول 2 3 روش¬های آماده¬سازی کوتیناز 30
جدول 3 1 مواد مورد استفاده در پایان¬نامه 53
جدول 3 2 مشخصات کامل مواد شیمیایی مورد نیاز در عملیات استخراج DNA 61
جدول 3 3 مواد مورد استفاده برای تهیه بافر TBE(10X) 68
جدول 3 4 مشخصات پرایمرهای RAPD 73
جدول 3 5 مواد مورد نیاز PCR 75
جدول 3 6 مواد مورد نیاز PCR با مستر میکس اماده 76
جدول 3 7 برنامه واکنش PCR مورد استفاده برای نشانگر RAPD 76
جدول 3 8 برنامه واکنش PCR برای پرایمرهای 16S rDNA 77
جدول 3 9 مواد مورد نیاز برای انجام PCR 6 نمونه با پرایمرهای16S rDNA 78
جدول3 10 16S rDNA primer 78
جدول 4 1بررسی میزان کوتین 82
جدول 4 2 بررسی میزان کوتین در خیارسبز 83
جدول 4 3 بررسی میزان کوتین در سیب زرد 84
جدول 4 4 بررسی میزان کوتین در سیب قرمز 85
جدول 4 5 تجزیه واریانس وزن کوتین نهایی بین میوه¬ها 85
جدول4 6 مقایسه میانگین میوه¬ها به روش دانکن در سطح احتمال 1% برای صفت وزن کوتین نهایی 86
جدول 4 7 فعالیت کوتینازی 6 نمونه 88
جدول 4 8 نتایج پرایمرهای RAPD حاصل از الکتروفورز افقی نمونه¬ها 89
فهرست شکل‌ها
شکل 2 1 ترسیم نمای ساختمان پوستک گیاه A) مرحله گستردگی کامل برگ B) تصویری با میکروسکوپ الکترونی از پوستک برگ بزرگنمایی 51000 برابر 9
2 2 مولکول کوتین و مونومرهایی که از هیدرولیز آن بدست می آید 10
شکل 2 3 نمایش شماتیکی از کوتیکول 11
شکل 2 4 a) ساختمان غیر مشخص و بینظم کوتیکول با میکروسکوپ الکترونی b) برآمدگی¬های کوتین میوه گوجه¬فرنگی با میکروسکوپ الکترونی 11
شکل 2 5 a) توالی پروتئینی آنزیم کوتیناز b) مکانیسم عمل آنزیم کوتیناز 16
شکل 2 6 هیدرولاز آلفا و بتا 20
شکل 2 7 ساختار کوتیناز 21
شکل 2 8 توانایی تجزیه (a) و سنتز(b) ترکیبات پلی استری توسط آنزیم کوتیناز 28
شکل2 9 مکانیسم عمل کوتیناز 40
2 10 گسترهی مقاومت آنزیم کوتیناز در برابر دما وpH 41
شکل 2 11نمودار دما و pH 41
شکل 2 12 دسته¬بندی نشانگرهای ژنتیکی 44
شکل 3 1 تهیه ژل آگارز 68
شکل 4 1مراحل مختلف استخراج کوتین در گوجه¬فرنگی 81
شکل 4 2 مراحل مختلف استخراج کوتین در خیارسبز 82
شکل 4 3 مراحل مختلف استخراج کوتین در سیب زرد 83
شکل 4 4 مراحل مختلف استخراج کوتین در سیب قرمز 84
شکل 4 5 مقایسه میزان کوتین 86
شکل 4 6 میزان فعالیت سویه¬ها 88
شکل 4 7 دندروگرام حاصل از تجزیه خوشهای 9 پرایمر RAPD با روش UPGMA 90
شکل 4 8 پلات دوبعدی حاصل از تجزیه به مولفه¬های اصلی نشانگر RAPD 91
شکل 4 9پلات سه بعدی حاصل از تجزیه به مولفه¬های اصلی نشانگر RAPD 92
شکل 4 10 ژل الکتروفورز افقی با آگارز 1% با استفاده از پرایمرها 93
شکل 4 11ژل الکتروفورز با آگارز 1% با پرایمرهای 16S rDNA 94